Schauplatz ist diesmal das von Gier und Korruption zerfressene Rom, wo sich Ezios Widersacher verschanzt haben. Um an sie heranzukommen, bedarf der Assassine tatkräftiger Unterstützung in Form der Bruderschaft. Der Spieler rekrutiert und trainiert zu diesem Zweck vielversprechende Nachwuchs-Assassinen, um sie anschließend ganz nach seinem Ermessen in der Metropole zu postieren und natürlich auch während der Missionen von ihren Talenten Gebrauch zu machen.
Neben der Bruderschaft arbeitet Ezio während seines Abenteuers auch wieder Hand in Hand mit historischen Persönlichkeiten, darunter unter anderem Niccolo Machiavelli, Caterina Sforza und der bereits vom Vorgänger bekannte Leonard da Vinci. Letzterer ist erneut für Ezios Waffenarsenal und andere technische Errungenschaften verantwortlich. So soll neben Giftpfeilen, Fallschirmen, verborgenen Doppelklingen und versteckten Pistolen auch eine verbesserte Flugmaschine ihren Weg ins Spiel finden.
Erstmals in der Geschichte der Spielserie soll "Assassin's Creed Brotherhood" zudem einen Mehrspieler-Modus bieten. Hierfür sollen unterschiedliche Klassen zur Auswahl stehen, die sich hinsichtlich ihrer Waffen und Fertigkeiten voneinander unterscheiden. Zu den unterschiedlichen Spielmodi hat Ubisoft bislang noch keine konkreten Angaben gemacht.
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